Western免疫印跡(WesternBlot)是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。
 

　　Western Blot 免疫印跡法樣品制備主要步驟：
 

　　原始樣品可為細胞、組織、培養上清、免疫沉淀或親和純化的蛋白，以下為 定性檢測目的蛋白時細胞樣品的處理方法，其余的樣品制備方法參閱相關文獻。
 

　　1、培養細胞或藥物處理。
 

　　2、棄培養基，用1X PBS漂洗細胞2次，去盡殘留培養基。
 

　　3、加入1X SDS樣品緩沖液(6-well plate,100μl /w或 75 cm2 plate,500- 1000μl/瓶) ，刮落細胞，轉移到Ep管。注意：冰上操作。
 

　　4、超聲 10~15秒剪切DNA以減低樣品粘性。
 

　　5、煮沸樣品5 minutes。
 

　　6、離心12000g，5 min，取上清。
 

　　7、電泳分離：上樣15μl~20μl 至 SDS-PAGE 膠 (10 cm x 10 cm)電泳。 如要定量檢測某蛋白的表達水平， 應用RIPA裂解液(1 ml per 107 cells/100 mm dish/150cm2 flask)裂解細胞， 收集裂解液至離心管中，在振蕩器上混勻4～15min，14000g離心15min(4℃)，棄沉淀，用Bradford法或其它蛋白質測定方法測定上清中蛋白濃度以調整上樣體積和上樣量，進行Western雜交時還需設置內或外參照，通常用beta-actin。
 

　　注意：一般上樣20~30 μg已足夠，如待檢蛋白為低豐度蛋白，可加大上樣量 至100μg，但電泳條帶易拖尾，可制備亞細胞組份或采用更敏感的檢測方法。
 

　　注意事項：
 

　　1、操作中戴手套，不要用手觸膜。
 

　　2、PVDF膜在甲醇中浸泡時間不要超過5秒。
 

　　3、如檢測小于20kD的蛋白應用0.2μm的膜，并可省略轉移時的平衡步驟。
 

　　4、某些抗原和抗體可被Tween-20 洗脫，此時可用1.0% BSA代替Tween-20。
 

　　5、關于封閉劑的選擇：5%脫脂奶/TBSor PBS: 能和某些抗原相互作用，掩蓋抗體結合能力；0.3~3% BSA in PBS：低的內源性交叉反應性。
 

　　6、如用0. 1% Tween20、0.02% NaN3 in PBSor TBS作封閉劑和抗體稀釋液，抗體檢測后可進行蛋白染色。
 

　　7、如要同時檢測大分子量和小分子蛋白，*用梯度膠分離蛋白。